Riviste Digitali: Biotecnologie 2000 N. 3 - Giugno 2006

<body> <table border="1"> <tr> <td>Fig.16 - La procedura del sistema AlkPhos Direct permette di attuare un protocollo completo dalla marcatura alla rivelazione risparmiando complessivamente 2-3 ore di tempo rispetto ai convenzionali sistemi indiretti basati sulla reazione aptene-anticorpo (Amersham Biosciences). 16a) 30 minuti - Il DNAss, l'RNA o il DNAds denaturato da marcare è miscelato con il tampone di marcatura e l'enzima AP. Si aggiunge quindi formaldeide per il crosslinking dell'enzima alla sonda. Non è necessario purificare la sonda prima dell'ibridazione. 16b) 2-4 ore (fino a 16 max) - La sonda è ibridizzata al blot usando il tampone specificamente formulato che stabilizza l'attività enzimatica. Dopo una preibridazione di 15 minuti, si procede con l'ibridazione overnight (per applicazioni in cui il target è presente in alta quantità bastano 2-4 ore). 16c)1-2 ore (fino a 16 max) - La rivelazione dei blot ibridizzati può essere chemiluminescente con il reagente CDPStar (1-2 ore in tutto) o chemifluorescente con il substrato ECF (1-16 ore per applicazioni ad alta sensibilità in cui è richiesta incubazione overnight con sustrato). reattivi Alexa Fluor 555 e 647 che fornisce un'ottima correlazione del segnale e un'alta risoluzione dei geni differenzialmente espressi. Generalmente i kit di retrotrascrizione contengono l'enzima M-MLV RT, anche se il mercato propone anche un tipo di kit che contiene AMV RT: un vantaggio per i test a doppio colore è che l'AMV RT non è in grado di distinguere tra Cy3 e Cy5, quindi l'efficienza di incorporazione è la stessa per entrambi i coloranti, diversamente da quanto accade con la M-MLV che incorpora il Cy3 più efficientemente del Cy5. Con molti dei kit per marcatura di cDNA/ cRNA si possono usare praticamente tutti i fluorocromi disponibili sul mercato nella forma reattiv a N - h y d r o x y s u c i n i m i d e , t r a cui fluoresceina, rodamina, Alexa, FITC, Texas Red, Cy3 e Cy5 che reagiscono con i gruppi aminoallilici incorporati nel cDNA (Fig. 10). Le figure 11 e 12 mostrano i risultati che si ottengono in esperimenti microarray con due kit diversi commerciali di marcatura del cDNA target: in entrambi i casi sono sufficienti basse quantità di RNA di partenza (1-5 ug) per avere spot chiari e riproducibili. Kit di marcatura diretta di sonde miRNA I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA a funzione regolatoria che stanno guadagnando sempre più l'interesse dei ricercatori e che per poter essere adeguatamente studiati devono essere marcati. Per la rivelazione di specifici miRNA, sono disponibili kit ottimizzati per la marcatura delle sonde sia con il metodo IVT sia col metodo della marcatura in 5': la marcatura mediante IVT è più economica della marcatura in 5' di sonde RNA oligonucleotidiche sintetizzate chimicamente produce sonde a più alta attività specifica, assicurando maggiore sensibilità. Sul mercato è anche disponibile una gamma di kit che utilizza un processo chimico brevettato per aggiungere direttamente cianine fluoresceinate all'RNA e ai miRNA: decine di nucleotidi ammino-modificati div 1 ersi possono essere attaccati all'estremità 3' di tali molecole (Fig. 13). Ad esempio, n kit di marcatura commerciale consente la rivelazione della maggior parte degli miRNA con meno di 10 mg di RNA totale di partenza ed è interamente compatibile con qualsiasi colorante ammino-reattivo, tra cui Cy3 e Cy5. Sistemi di marcatura chimica diretta di DNA e RNA È stata recentemente introdotta sul mercato una nuova tecnologia per la marcatura chimica e non enzimatica di DNA, RNA e oligonucleotidi. Questa tecnologia può essere usata al posto di qualsiasi altro metodo di marcatura, tra cui nick translation, random prime, marcatura terminale o marcatura dell'RNA. Poiché non enzimatici, questi kit sono estremamente riproducibili. Diversamente dai metodi enzimatici come il random prime, in cui il DNA marcato è generato dall'incorporazione di nucleotidi coniugati a un aptene o fluorofoto, il sistema incorpora un'unità di platino che funziona come linker tra l'acido nucleico e l'aptene: si può usare dunque un unico kit per mercare DNA, RNA o oligonucleotidi (fig. 14). Sono disponibili due sistemi di marcatura a seconda dell'aptene utilizzato (DNP o Fluoresceina): entrambi sono veloci (15-30 minuti) e di facile uso. La semplicità della procedura ULS è chia ramente visibile nella figura 15. Gli acidi nucleici marcati con questo sistema sono stabili indefinitamente e sono adatti per analisi Southern e Northern , ibridazione in situ di RNA e DNA, FISH, CGH e analisi microarray. E' disponibile anche un sistema commerciale di marcatura chimica con si possono risparmiare ore eliminando i passaggi con l'anticorpo: le sonde di DNA o RNA sono marcate direttamente con un'enzima AP termostabile in una reazione di 30 minuti. Le sonde risultanti possono essere utiliz zate per successivi esperimenti di ibrida zione senza alcun preventivo passaggio di purificazione (Fig. 16). Un altro kit p r e s e n t e s u l m e r c a t o c o n s e n t e l a m a r c atura diretta del DNA con l'enzima HRP in appena 15 minuti, producendo una sonda stabile per un anno. Questo sistema è velo- ce (2 ore dalla marcatura alla rivelazione) e molto più sensibile dei metodi di marcatura radioattiva. RINGRAZIAMO LE AZIENDE CHE, FORNENDOCI IL LORO MATERIALE, HANNO RESO POSSIBILIE LA STESURA DI QUESTO ARTICOLO ABI Advanced Biotech Italia Adaltis Agilent Amersham Biosciences Bio-Rad Celbio ICN Pharmaceuticals Italy Invitrogen M-Medical Perkin Elmer Life Sciences Via Tiepolo 24 20052 Monza (MI) Tel. 039/23831 Fax 039/2383490 Prodotti Gianni - Div. Ricerca Promega Italia Qiagen Roche Applied Science Sigma-Aldrich SPA - Divisione BioSPA Space Import Export rossa (ad esempio, Cy5), rispettivamente, permettendo così di analizzare nello stesso esperimento sia i geni `test' sia quelli di contro ad_It lternativa la cop 18:43 Page Taqman llo. In a(297x205) al2/5/06pia Cy3/Cy5 si può usare coppia di coloranti ammino - Formulate per performances superiori. Per migliorare i risultati in Real-Time PCR. Le nuove ot Master Mix prestazione anche con i timizzate TaqMan offrono una eccezionale, target più difficili. ® TaqMan® Gene Expression Master Mix offre sia una sensibilità superiore in grado di rilevare fino alla singola copia, che una elevatissima specificità necessaria a differenziare sequenze omologhe. Soluzioni integrate. Le nuove TaqMan® Master Mix fanno parte di una soluzione completa che include strumentazione, saggi, reagenti e softwares sviluppati da Applied Biosystems appositamente per garantire la massima sensibilità, specificità ed accuratezza da un esperimento di Real-Time PCR. Contattate l'ufficio Applied Biosystems di Monza (tel 039 83891) e richiedete subito un campione GRATUITO. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. This product is an Authorized 5' Nuclease Core Kit. Its purchase is accompanied by immunity from suit under patent claims specified in the product insert to use only the amount purchased for the purchaser's own internal research. No other patent rights are conveyed expressly, by implication or by estoppel. Applied Biosystems and AB (Design) are registered trademarks and Applera is a trademark of the Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. © 2006 Applied Biosystems. All rights reserved. YEARS 24 - Biotecnologie 2000 - Giugno 2006 </td> <td>LA R I V I S TA D E L L A B O R AT O R I O B I O T ECNOLOGICO Tecniche Nuove Spa - Via Eritrea, 21- 20157 Milano Tel. 02/390901 Fax. 02/39090332 http://www.tecnichenuove.com 2000.COM ECNOLOGIE WWW.BIOT Anno VI- N. 3 GIUGNO 2006 ISSN 1720 0350 · FA R M A C E U T I C A · D I A G N O S T I C A · A G R O A L I M E N TA R E · A M B I E N T E · ARTICOLI: ·RT Profiler PCR Array Tebu-Bio.............pag.6 ·Nuove tendenze nell'automazione d i l a b o r a t o r i o. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p a g . 8 ·Biosigma, le Biotecnologie del futuro..pag.13 ·DNA di crostacei negli alimenti.......pag.18 ·Guida alla scelta: Kit e prodotti per la marcatura non radioattiva degli acidi nucleici..............................................pag.20 RUBRICHE: ·Kiteprodotti....................................pag.2 ·Fatti............................................pag.4 ·Appuntamenti..............................pag.10 ·Le aziende a portata di mouse........pag.11 ·Uno sguardo al futuro....................pag.15 ENTRA NEL MONDO DELLE BIOTECNOLOGIE: CONOSCI TUTTE LE NOVITÀ DEL MERCATO </td> </tr> <tr> <td></td> <td><a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/3?targetPagNum=003">vai a pagina 003</a></td> </tr> <tr><td colspan="2">Vai agli altri numeri disponibili:<br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2005/5">Settembre 2005</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/1">Febbraio 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/2">Aprile 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/3">Giugno 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/4">Settembre 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/5">Ottobre 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2006/6">Dicembre 2006</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/1">Febbraio 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/2">Aprile 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/3">Giugno 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/4">Settembre 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/5">Ottobre 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2007/6">Dicembre 2007</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/1">Febbraio 2008</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/2">Aprile 2008</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/3">Giugno 2008</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/4">Settembre 2008</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/5">Ottobre 2008</a><br/> <a href="http://www.rivistedigitali.com/Biotecnologie_2000/2008/6">Dicembre 2008</a><br/> </td></tr> <tr><td colspan="2"><p>La visualizzazione ottimale di questo sito richiede un browser che supporti i frames o che i frames siano attivati.</p></td></tr> </table> </body>